انواع کشت باکتری

۱- کشت باکتری در محیط کشت مایع (براث)

۲- کشت باکتری در محیط کشت جامد(آگار)

روش کشت باکتری در محیط کشت مایع

۱- ابتدا یک آنس برداشته و آنرا در دست راست بگیرید . بعد آنرا روی شعله کاملا سترون کنید و بگذارید تا سرد شود.

۲- محیط حاوی باکتری (لوله یا پلیت) را در دست چپ بگیرید و درب آنرا با دست راست در کنار شعله باز کنید . دقت کنید که درب محیط کشت را روی میز کار خود نگذارید.

۳- اگر محیط کشت در لوله است دهانه آنرا چند با ر از روی شعله عبور دهید تا سترون شود همچنین درب لوله را بیش از حد باز نگه ندارید.

۴- نوک آنس را وارد محیط کرده و یک لوپ از آنرا بردارید. منظور از لوپ سوزن کشت با نوک حلقه ای است .

۵- دهانه لوله را مجددا با شعله سترون کرده و درب آنرا بگذارید و محیط کشت را در جای خود قرار دهید.

۶- لوله حاوی محیط کشت را در دست چپ بگیرید و نوک آنس آلوده به باکتری مورد نظر را داخل محیط فرو برده و به آرامی تکان دهید تا میکروبها در محیط پخش شوند.

۷- در مواردی که میکروب را از پلیت (محیط کشت جامد) برمی دارید با نوک آنس کمی از پرگنه را برداشته و با رعایت موارید که گفته شد آنرا داخل محیط مایع فرو برده و به آرامی هم بزنید تا همگن شود.

۸- دهانه لوله حاوی محیط کشت جدید را با شعله سترون کرده و درب آنرا بگذارید و آنرا در داخل انکوباتور قرار دهید.

۹- نوک آنس را مجددا با شعله استریل کرده و در جای خود قرار دهید.

روش کشت باکتری در محیط جامد

محیط کشت باکتری در محیط جامد به دو صورت وجود دارد : ۱- محیط کشت باکتری در محیط جامد در لوله ۲- محیط کشت باکتری در محیط جامد در پلیت.

در لوله به دوصورت عمودی(Stab Culture)و شیبدار(Slant Culture )دیده می شود که هر کدام از آنها روش کشت خاص خود را دارند.

روش کشت عمقی در لوله

در اینحالت محیط کشت باکتری آگاردار (جامد) را با حفظ شرایط استریل در حالت مذاب داخل لوله های آزمایش استریل ریخته و بحالت عمودی آنرا در یک جای ساکن قرار دهید تا سرد شود. در اینحالت با آنس نوک تیز استریل شده در کنار شعله از پرگنه باکتری مقداری را برداشته و آنرا بصورت عمودی در مرکز این محیط تا انتها فرو برده و بدون هیچگونه تغییر حالتی آنرا از همان مسیر خارج کنید . بعد لوله را در انکوباتور قرار دهید .

این روش کشت دارای خصوصیاتی می باشد و آن اینست که هنگامی که نوک آنس را در محیط فرو می برید در ابتدای ورود آنس به محیط تراکم باکتری زیاد است و به ترتیب که به عمق محیط فرو می رود از تعداد باکتریها کاسته می شود تا به انتهای لوله که می رسد تراکم باکتری با حداقل می رسد و از طرفی در انتها محیط کشت لوله ای اکسیژن کمتر از قسمت سطحی آن است و باکتریها به ترتیبی با تراکمی که وارد محیط شده اند براساس نیاز با اکسیژن (هوازی یا بیهوازی بودن )در محیط رشد متفاوتی دارند یعنی اگر باکتری هوازی باشد رشد آن در قسمت سطحی بیشتر است و اگر بیهوازی باشد رشد آن در قسمت عمقی بیشتر می شود.

روش کشت در سطح شیبدار در لوله

در اینحالت محیط کشت آگاردار استریل را در لوله های استریل شده ریخته و قبل از سرد شدن آنها را بحالت شیبدار قرار می دهند تا سرد شوند. در اینحالت با آنس نوک تیز با حفظ شرایط استریل از پرگنه باکتری برداشته و در کنار شعله نوک آنس را ابتدا بصورت عمودی وارد قسمت عمودی محیط کشت کرده بعد به آرامی آنرا از همان مسیر خارج کرده و بدون اینکه نوک آنس از محیط جدا شود آنرا به حالت زیگزاک روی سطح شیبدار بکشید.

این روش هم خصوصیات بسیار زیادی از جهت تشخیص سویه های باکتری دارد و اطلاعاتی در مورد هوازی یا بی هوازی بودن آنها و همچنین خصوصیات منحصر به فرد باکتریها به ما می دهد . مثلا ممکن است درکشت یک نوع باکتری ، رنگ قسمت عمودی محیط کشت تغییرکند که نشانگر بی هوازی یا بیهوازی اختیاری بودن باکتری است که بعدا در تستهای اختصاصی دیگر را روی آن انجام می دهیم.یا مثلا باکتریها فقط در قسمت شیبدار رشد می کنند و رنگ آن قسمت تغییر می کند که پی به هوازی بودن آن می برید.

روش دیگر کشت روی این محیط از محیط مایع می باشد که یک لوپ از کشت مایع باکتریایی برداشته و در سطح شیبدار بصورت زیگراک می کشید و کشت می دهید.

روش تهیه محیطهای کشت

مطابق دستور کارخانه سازنده و با توجه به بروشور الصاقی روی آن می توان مقدار لازم از محیط کشت که بصورت پودری یا پلیت شده می باشد را برداشته و با مقدار توصیه شده آب مقطردر داخل ارلن مخلوط کنید بعد آنرا با توجه به دستور کارخانه اگر لازم بود روی شعله قرار داده تا بر اثر حرارت شفاف شود که البته در بعضی از محیطها نیازی به این کار نیست .

بعد آن را در اتوکلاو قرار داده و بمدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد قرار می دهید تا استریل شود . بعضی از محیطهای کشت که به دمای بالا حساس می باشند در اتوکلاو قرار نمی گیرند و این مسئله را کارخانه سازنده حتما متذکر شده است . بعد از اتوکلاو گذاری محیطهای کشت آگار دارداخل ارلن سفت می شود و برای استفاده از آنها باید دوباره حرارت داده شوند ولی محیطهای کشت مایع به شکل مایع باقی می مانند و آماده مصرف هستند.

روش تهیه محیط پیش ریخته

بعد از تهیه محیط کشت که قبلا توضیح داده شد ، برای تهیه محیط پیش ریخته باید از محیطهای آگار دار(جامد) استفاده نمود به ترتیب که ابتدا ارلن حاوی محیط کشت را روی شعله قرار دهید تا کاملا مذاب شود. بعد تازمانی که دمای آن به حدود ۴۵ درجه سانتیگراد برسد صبر می کنید. چون اگر دمای آن بالاتر باشد بخار زیادی روی درب پلیت جمع می شود . بعد از رسیدن به دمای مطلوب در کنار شعله و با حفظ موازین استریل از محیط کشت بمقدار ۱۵ تا ۲۰ سی سی در پلیتهای استریل می ریزید و بعد درب آنرا گذاشته و در یک جای ساکن می گذارید تا سرد شوند. در اینحالت محیط پیش ریخته آماده می باشد.

کشت در پلیت : به سه روش قابل انجام است :

۱- کشت خطی       ۲- کشت سطحی          ۳- کشت آمیخته یا پورپلیت

روش کشت خطی

در این روش از محیط پیش ریخته استفاده می شود. به این ترتیب که ابتدا بوسیله یک آنس سترون شده مقداری از پرگنه باکتری را برداشته و آنرا روی سطح محیط پیش ریخته بصورت خطهای موازی و در چند جهت می کشیم . در کشتهای خطی برای بدست آوردن کلنی های تک می توانیم پلیت را به ۴ قسمت تقسیم کنید. بعد در قسمت اول ابتدا نوک لوپ را که محتوی پرگنه باکتری است را بصورت خطهای موازی کشیده و بعد خطوط را در منطقه دوم از انتهای خط انتهایی منطقه اول در جهت دیگر ادامه می دهیم و در منطقه سوم و چهارم هم به همین صورت عمل می کنیم .

خصوصیت این روش این است که وقتی خطوط موازی را روی سطح محیط می کشیم به ترتیب از تراکم باکتریها کاسته می شود و به انتهای خط که می رسیم تراکم باکتری کمتر است و در منطقه دیگر وقتی از انتهای خط منطقه قبلی استفاده می کنیم. در واقع تراکم بسیار کمتر از تراکم باکتریها در ابتدا می باشد و در نتیجه در مناطق دیگر هم به ترتیب از تعداد باکتریها کاسته می شود تا جائیکه در منطقه چهارم شما می توانید پرگنه های تکی داشته باشیم که کلنی خالص نامیده می شود.

بنابراین انجام درست کشت خطی منجر به ایجاد کلنی خالص می شود. این کلونی تنها از یک باکتری مادری بوجود می آید (تعریف کلنی خالص). باکتریهای منفرد را باکتریهای مادر می نامند که این باکتریها پس از کشت خطی و جدا شدن سلولهای باکتری از یکدیگر بوجود می آیند.

باید توجه داشته باشیم که کلنی خالص به کلنی گفته می شود که با کلنی دیگر تماس نداشته باشد.

در مورد محیطهای کشت باکتریایی که بصورت مایع می باشند برای انجام کشت خطی روی محیط پیش ریخته فقط یکبار لوپ را داخل محیط محتوی باکتری کرده و یک لوپ از آن برداریم. سپس آنرا روی محیط پیش ریخته قرار داده و بصورت خطوط موازی آنرا در چند جهت بکشیم و یا مراحل فوق را روی آن انجام دهیم.

کشت سطحی

این روش کشت بیشتر برای محیطهای مایع میکروبی کاربرد دارد و یا اگر محیط مایعی مانند شیر مشکوک به آلودگی میکروبی باشد آن را می توان به این روش کشت میکروبی داده و میکروارگانیسمهای موجود در آن را مشخص نمود.

برای اینکار ابتدا یک رقت معینی از محیط مایع تهیه می کنیم. سپس با استفاده از پیپت استریل مقدار مشخصی از آن رقت را برداشته و در سطح محیط جامد پیش ریخته توسط میله پخش کننده یا توک آنس پخش نمائید. و بعد از انکوباسیون می توانیم کلنی های رشد یافته در سطح محیط کشت را مشاهده کنیم. باید توجه داشته باشیم که هنگام انجام کشت سطحی باید سطح محیط خشک باشد .

چون هنگام ریختن محیط کشت بصورت پیش ریخته ممکن است بخار آب روی درب پلیت و سطح محیط جمع شود ، برای خشک کردن آن می توان محیطها را در یک گرمخانه با دمای ۵۰-۲۵ درجه قرار داده و خشک نمود. به این ترتیب که درب پلیت را برداشته و قسمت محتوی محیط کشت را وارونه روی لبه درب قرار دهیم تا قطرات رطوبت حذف گردد.

همچنین می توانیم پس از ریختن محیط کشت در پلیت در صورت تجمع حباب هوا ، آنها را با شعله دادن سطح محیط حذف نمائیم. اینکار باعث سترون شدن سطح محیط کشت هم می شود.

کشت آمیخته یا پورپلیت

در این روش کشت هم نیاز به تهیه سوسپانسیون از باکتری می باشد . یعنی باید از باکتری مورد نظر در محیط مایع رقت معینی را تهیه نموده بعد به میزان ۱ سی سی از آنرا در کف پلیت استریل ریخته ، سپس از محیط کشت مورد نظر که قبلا استریل شده و حرارت آن به حدود ۴۵ درجه سانتیگراد رسیده بمیزان ۱۵-۲۰ سی سی به پلیت اضافه نمائید. سپس با حرکات دورانی بصورت عدد ۸ انگلیسی آنرا کاملا مخلوط کنیم. اگر نیاز بود مجددا سطح محیط آمیخته با باکتری را با یک لایه نازکی از همان محیط کشت بپوشانیم. دراینحالت به آن کشت دولایه هم گفته می شود.

 

****    ****   ****

تیم تولید محتوای سایت توت مدیا امیدوار است این مقاله مورد استفاده شما قرار گرفته باشد.

جهت دسترسی به سایر مقالات درسی کلیک نمائید